鉴黑担保网源码

    
鉴黑担保网源码
食品安全国家标准-食品微生物学检验-沙门氏菌检验

GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

录入时间:2010-4-28 9:02:54 来源:国家卫生部

前言
本标准代替 GB/T 4789.4-2008《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.4-2008 相比,主要变化如下
——修改了标准的中英文名称;
——修改了标准的范围;
——修改了培养基和试剂;
——修改了设备和材料;
——修改了附录 A。
本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。
本标准所代替的历次版本发布情况为:
——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。

食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:2 ℃~5 ℃。
2.2 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃,42 ℃±1 ℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平:感量 0.1 g。
2.6 无菌锥形瓶:容量 500 mL,250 mL。
2.7 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿:直径 90 mm。
2.9 无菌试管:3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
2.10 无菌毛细管
2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
2.12 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(BPW): 见附录 A 中 A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见附录 A 中 A.2。
3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见附录 A 中 A.3。
3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见附录 A 中 A.4。
3.5 HE 琼脂:见附录 A 中 A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见附录 A 中 A.6
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁(TSI)琼脂:见附录 A 中 A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见附录 A 中 A.8。
3.10 尿素琼脂(pH 7.2):见附录 A 中 A.9。
3.11 氰化钾 (KCN) 培养基:见附录 A 中 A.10。
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录 A 中 A.11。
3.13 糖发酵管:见附录 A 中 A.12。
3.14 邻硝基酚-D 半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录 A 中 A.13。
3.15 半固体琼脂:见附录 A 中 A.14。
3.16 丙二酸钠培养基:见附录 A 中 A.15。
3.17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。

4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图 1。
沙门氏菌检验程序

图 1 沙门氏菌检验程序

5 操作步骤
5.1 前增菌
称取 25 g(mL)样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中,以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1 min~2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样 品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需测定 pH 值,用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8±0.2。
无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中,如使用均质袋,可直接进行培养,于 36 ℃±1 ℃培养 8 h~ 18h。
如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃~5 ℃不超过 18 h 解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取 1 mL,转种于 10 mL TTB 内,于 42 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。同时,另取 1 mL,转种于 10 mL SC 内,于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
5.3 分离
分别用接种环取增菌液 1 环,划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板(或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h~24 h (XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板) 或 40 h~48 h (BS 琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。
表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板

沙门氏菌

BS 琼脂

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。

HE 琼脂

蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。

XLD 琼脂

菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。

沙门氏菌属显色培养基

按照显色培养基的说明进行判定。

5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h~24 h,必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属 的反应结果见表 2。

表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

 

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

K

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

A

A

+(-)

+(-)

可疑沙门氏菌属

A

A

+/-

+/-

非沙门氏菌

K

K

+/-

+/-

+/-

非沙门氏菌

注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。

 

注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试 验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h,必要时可延长至 48 h,按表 3 判定结果。将已挑菌 落的平板储存于 2 ℃~5 ℃或室温至少保留 24 h,以备必要时复查。

表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢
(H2S)

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾
(KCN)

赖氨酸脱羧酶

A1

A2

A3

+/-

注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。

注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。
5.4.2.1 反应序号 A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常,按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。

表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH 7.2 尿素

氰化钾(KCN)

赖氨酸
脱羧酶

判 定结果

甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)

沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)

沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)

注:+表示阳性;+表示阴性。

 

注:+表示阳性;+表示阴性

5.4.2.2 反应序号 A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号 A3:补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别

项目

卫矛醇

山梨醇

水杨苷

ONPG

丙二酸盐

KCN

注:+表示阳性;-表示阴性。

 

注:+表示阳性; -表示阴性。

5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据 5.4.1 的初步判断结果,从营 养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 抗原的准备
一般采用 1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的 (如 2%~3%) 培养基上再检查;如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时,可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时,将菌株接种在 0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,俟菌落 蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有 0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管 1 次~2次,自远端取菌培养后再检查。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域,挑取 1 环待测菌,各放 1/2 环于玻片上的每一区域上 部,在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入 1 滴生理盐水,作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min,并对 着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定
同 5.5.2。
5.5.4 血清学分型(选做项目)
5.5.4.1 O 抗原的鉴定
用 A~F 多价 O 血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形 菌株,不能分型。
被 A~F 多价 O 血清凝集者,依次用 O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2 和 O11 因子血清做凝集 试验。根据试验结果,判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株,再用 O10、O15、O34、O19 单因 子血清做凝集试验,判定 E1、E2、E3、E4 各亚群,每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因 子血清的检查结果,没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。
不被 A~F 多价 O 血清凝集者,先用 9 种多价 O 血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种 血清所包括的 O 群血清逐一检查,以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下:
O 多价 1 A,B,C,D,E,F,群 (并包括 6,14 群)
O 多价 2 13,16,17,18,21 群
O 多价 3 28,30,35,38,39 群
O 多价 4 40,41,42,43 群
O 多价 5 44,45,47,48 群
O 多价 6 50,51,52,53 群
O 多价 7 55,56,57,58 群
O 多价 8 59,60,61,62 群
O 多价 9 63,65,66,67 群
5.5.4.2 H 抗原的鉴定
属于 A~F 各 O 群的常见菌型,依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。
表 6 A~F 群常见菌型 H 抗原表

O 群

第 1 相

第 2 相

A
B
B
C1
C2
D(不产气的)
D(产气的)
E1
E4
E4

a
g,f,s
i,b,d
k,v,r,c
b,d,r
d
g,m,p,q
h,v
g,s,t
i



2
5,Z15
2,5


6,w,x

 

不常见的菌型,先用 8 种多价 H 血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种 血清所包括的各种 H 因子血清逐一检查,以第 1 相和第 2 项的 H 抗原。8 种多价 H 血清所包括的 H 因子如下:

H多价1 a,b,c,d,i
H多价2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多价3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6 z39,z41,z42,z44
H多价7 z52,z53,z54,z55
H多价8 z56,z57,z60,z61,z62

每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果,没有 H 单因子血清的要用两 个 H 复合因子血清进行核对。
检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可 在琼脂斜面上移种 1~2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原,要用位相变异的方法检查其另一 个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
小玻管法: 将半固体管(每管约 1 mL~2 mL) 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃,取已知相的 H 因子血清 0.05 mL~0.1 mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试 验的小玻管内,俟凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁 放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端 挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细 菌的动力不能抑制。一般按原血清 1:200~1:800 的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管 (下端开口要留一个缺口,不要平齐) 放在半固体管内,小玻 管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至 50 ℃,挑取因子 血清 1 环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管 中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或 转种 1%软琼脂斜面,于 37 ℃培养后再做凝集试验。
简易平板法:将 0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清 1 环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓 延生长的菌苔边缘取菌检查。
5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定
用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林 沙门氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录 A 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25 g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。

食品微生物学检验2010标准
食品微生物学检验2010标准(GB 4789)已于2010年3月正式颁布并于2010-06-01开始实施.
详细请看:
GB 4789-2010检验标准
GB 4789-2010培养基目录
食品微生物学检验2010标准
GB 4789.1-2010 总则
GB 4789.2-2010 菌落总数测定
GB 4789.3-2010 大肠菌群计数
GB 4789.4-2010 沙门氏菌检验
GB 4789.10-2010 金黄色葡萄球菌检验
GB 4789.15-2010 霉菌和酵母计数
GB 4789.18-2010 乳与乳制品检验
GB 4789.30-2010 单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB 4789.35-2010 乳酸菌检验
GB 4789.40-2010 阪崎肠杆菌检验
鉴黑担保网源码 | 联系我们 | 在线客服 | 网上商城 | 网站地图