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食品安全国家标准-食品微生物学检验-乳酸菌检验

GB 4789.35-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验

录入时间:2010-4-28 9:02:54 来源:国家卫生部

前 言
本标准代替GB/T 4789.35-2008《食品卫生微生物学检验 食品中乳酸菌检验》。
本标准与GB/T 4789.35-2008相比,主要变化如下:
——修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。
本标准的附录A为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
—— GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。

1 范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的检验方法。
本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。

2 规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日

期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。

3 术语和定义
3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria
一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、
双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus)。

4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
4.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
4.2 冰箱:2℃~5℃。
4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
4.4 天平:感量 0.1 g。
4.5 无菌试管:18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
4.6 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
4.7 无菌锥形瓶:500 mL、250 mL。

5 培养基和试剂
5.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基及莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良 MRS 培养基:见附录 A 中 A.1。
5.2 MC 培养基(Modified Chalmers 培养基):见附录 A 中 A.2。
5.3 0.5 %蔗糖发酵管:见附录 A 中 A.3。
5.4 0.5 %纤维二糖发酵管:见附录 A 中 A.3。
5.5 0.5 %麦芽糖发酵管:见附录 A 中 A.3。
5.6 0.5 %甘露醇发酵管:见附录 A 中 A.3。
5.7 0.5 %水杨苷发酵管:见附录A中A.3。
5.8 0.5 %山梨醇发酵管:见附录A中A.3。
5.9 0.5 %乳糖发酵管:见附录A中A.3。
5.10 七叶苷发酵管:见附录A中A.4。
5.11 革兰氏染色液:见附录A中A.5。
5.12 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin):化学纯。

6 检验程序

乳酸菌检验程序见图1。
乳酸菌检验程序

 

7 操作步骤

7.1 样品制备

7.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
7.1.2 冷冻样品可先使其在 2℃~5℃条件下解冻,时间不超过 18 h,也可在温度不超过 45℃的条件,解冻时间不超过15min。
7.1.3 固体和半固体食品:以无菌操作称取 25 g 样品,置于装有 225 mL 生理盐水的无菌均质杯内, 于 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,制成 1:10 样品匀液;或置于 225 mL 生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min 制成 1:10 的样品匀液。
7.1.4 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶(瓶
内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成 1:10 的样品匀液。
7.2 步骤
7.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
7.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做 10 倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次 1mL 灭菌吸管或吸头。
7.2.3 乳酸菌计数
7.2.3.1 乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计,选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2 个 MRS 琼
脂平板,使用 L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃,厌氧培养 48 h±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要
求在 15min 内完成。
7.2.3.2 双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 0.1 mL样品匀液于莫匹罗星锂盐
(Li-Mupirocin)改良 MRS 琼脂平板,使用灭菌 L 形棒进行表面涂布,每个稀释度作两个平板。36℃±1℃,厌氧培养 48 h
±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。
7.2.3.3 嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2
个 MC 琼脂平板,使用 L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃,需氧培养 48 h±2 h 后计数。嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌
落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径 2 mm±1 mm,菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15 min 内完成。
7.2.3.4 乳杆菌计数
7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
7.3 菌落计数
可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落 形成单位(colony-forming units,CFU)表示。
7.3.1 选取菌落数在 30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数,大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以 2,代表一个平板菌落数。
7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
7.4 结果的表述
7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每 g(mL)中菌落总数结果。
7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式(1)计算:

计算公式

式中:
N——样品中菌落数;
C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n 1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n 2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d——稀释因子(第一稀释度)。
7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可
记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。
7.4.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。
7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间,其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时,则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.5 菌落数的报告
7.5.1 菌落数小于 100 CFU 时,按"四舍五入"原则修约,以整数报告。
7.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时,第 3 位数字采用"四舍五入"原则修约后,取前 2 位数字,后 面用 0 代替位数;也可用 10 的指数形式来表示,按"四舍五入"原则修约后,采用两位有效数字。
7.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告,体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
8 结果与报告
根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。
9 乳酸菌的鉴定(可选做)
9.1 纯培养
挑取 3 个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板,乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板,置
36 ℃±1 ℃厌氧培养 48 h。
9.2 鉴定
9.2.1 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。
9.2.2 涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞,革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为 0.5m~2.0m,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性。
9.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表 2。

乳酸菌菌种主要生化反应

食品微生物学检验2010标准
食品微生物学检验2010标准(GB 4789)已于2010年3月正式颁布并于2010-06-01开始实施.
详细请看:
GB 4789-2010检验标准
GB 4789-2010培养基目录
食品微生物学检验2010标准
GB 4789.1-2010 总则
GB 4789.2-2010 菌落总数测定
GB 4789.3-2010 大肠菌群计数
GB 4789.4-2010 沙门氏菌检验
GB 4789.10-2010 金黄色葡萄球菌检验
GB 4789.15-2010 霉菌和酵母计数
GB 4789.18-2010 乳与乳制品检验
GB 4789.30-2010 单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB 4789.35-2010 乳酸菌检验
GB 4789.40-2010 阪崎肠杆菌检验
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